组蛋白修饰是调控染色质结构与基因表达的重要分子机制，对维持细胞功能、基因组稳定性以及细胞分化等过程起着关键作用。在细胞核中，DNA（脱氧核糖核酸）作为一种携带遗传信息的生物大分子，负责指导RNA和蛋白质的合成，确保生物体的正常发育与运作。DNA分子呈双螺旋结构，并缠绕在组蛋白上形成核小体。这些核小体以串珠状的形式排列，进一步压缩形成染色质（chromatin），而染色质在细胞分裂过程中则会进一步折叠压缩形成染色体。在此过程中，组蛋白修饰通过乙酰化、甲基化、磷酸化等不同的化学修饰形式，调控染色质的开放或关闭状态，从而影响基因表达的活性。CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技术利用抗体识别目标蛋白或特定的染色质修饰标记，并通过蛋白酶Tn5转座酶（Tagmentase）在目标位点上进行高效的DNA片段化和文库构建，能够用于研究转录因子或组蛋白修饰在全基因组上的结合位点。
图1. 不同组蛋白翻译后修饰位点（Nat Rev Genet 23, 563–580 (2022)）
在探究蛋白质与DNA相互作用及组蛋白修饰机制时，传统技术ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing，染色质免疫共沉淀测序）仍存在一些局限性，如对细胞起始量要求较高、容易产生假阴性或假阳性结果、重复性较差、信噪比低等问题。为克服此技术瓶颈，2019年Henikoff实验室在Nature Communications上公布的CUT&Tag技术显著降低了细胞样本的起始量需求，同时在数据的信噪比、重复性以及检测灵敏度等方面取得了突破性进展。通过特异性抗体识别特定组蛋白修饰位点，结合CUT&Tag技术的高通量检测能力，科学家能够精准地绘制全基因组范围内的组蛋白修饰图谱，进一步解析这些修饰在染色质结构重塑和基因转录调控中的关键作用。
图2. CUT&Tag与CHIP-seq的数据比对（Nat Commun 10, 1930 (2019)）
CUT&Tag主要步骤为：
（1）提取细胞核并与磁珠结合：可以用活细胞，也可以使用抽核的细胞核。ConA磁珠能与细胞膜上的糖蛋白结合，使用洋地黄皂苷（digitonin）透化细胞膜。
（2）一抗、二抗结合：一抗是针对靶蛋白的特异性抗体，一抗孵育后，用含洋地黄皂苷的洗涤缓冲液快速洗涤，然后将细胞核与二抗一起孵育。
（3）ChiTag转座体结合抗体：一般使用Protein A/G-Tn5体系来实现Tn5转座酶的结合。
（4）Tn5转座酶激活与片段化：通过添加含有Mg2+的反应液使Tn5转座酶开始发挥作用，在打断靶蛋白结合的DNA区域的同时将携带的建库接头连接到DNA片段上。
（5）测序与数据分析：包括数据质控、参考基因组比对分析、frag分析、富集峰分析、富集峰Motif分析、Peak富集区域差异比较分析。
图3. CUT&Tag方法流程（Nat Commun 10, 1930 (2019)）
相关应用文献一：
标题：Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer’s disease
阿尔茨海默病组蛋白H4赖氨酸12乳酸化对小胶质细胞糖代谢的正反馈调节
期刊：Cell Metabolism
IF：27.7
时间：2022
研究概要：
图4
主要研究内容：
具体内容：小胶质细胞的促炎激活是阿尔茨海默病（AD）的一个标志，这一过程涉及从氧化磷酸化（OXPHOS）向糖酵解的转变。研究展示了小胶质细胞中的正反馈循环如何驱动AD的发病机制，并且证明抑制小胶质细胞中的这一循环可以改善AD小鼠模型（5XFAD）中的Aβ负担和认知缺陷。在5XFAD小鼠和AD患者的脑样本中首次检测到组蛋白乳酸化升高后，观察到Aβ斑块邻近小胶质细胞中H4K12la水平升高。这种乳酸依赖性组蛋白修饰在糖酵解基因的启动子上富集并激活转录，从而增加糖酵解活性。最终，糖酵解/H4K12la/PKM2正反馈回路加重了AD的小胶质细胞功能障碍。药理抑制PKM2可减弱小胶质细胞的激活，而小胶质细胞特异性消融PKM2可改善AD小鼠的空间学习和记忆。因此，研究表明破坏正反馈回路可能是治疗AD的一种潜在的治疗方法。
相关应用文献二：
标题：A feedback loop driven by H3K9 lactylation and HDAC2 in endothelial cells regulates VEGF-induced angiogenesis
内皮细胞中由H3K9乳酸化和HDAC2驱动的反馈回路调节vegf诱导的血管生成
期刊：Genome Biology
IF：10.1
时间：2024
研究概要：
图5
主要研究内容：
血管内皮生长因子（VEGF）是最重要的促血管生成因子之一，在多种疾病中起着重要作用。糖酵解速率增加和乳酸积累与病理性血管生成有关。研究发现内皮细胞中H3K9乳酸化（H3K9la）和组蛋白去乙酰化酶2 （HDAC2）之间的反馈回路驱动vegf诱导的血管生成。内皮细胞中的H3K9la水平在对VEGF刺激的反应中上调。糖酵解的药理学抑制降低H3K9的乳酸化并减弱新生血管。CUT& Tag分析显示，H3K9la富集于一组血管生成基因的启动子上并促进其转录。有趣的是，H3K9的高乙酰化抑制了乙酰化擦除酶HDAC2的表达，而HDAC2的过表达则降低了H3K9的乙酰化并抑制了血管生成。总之，H3K9la对vegf诱导的血管生成很重要，中断H3K9la/HDAC2反馈回路可能代表了一种治疗病理性新生血管的新方法。
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参考文献：
[1]Millán-Zambrano G, Burton A, Bannister AJ, Schneider R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 2022 Sep;23(9):563-580. doi: 10.1038/s41576-022-00468-7. Epub 2022 Mar 25. PMID: 35338361.
[2]Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, Pledger ES, Bryson TD, Henikoff JG, Ahmad K, Henikoff S. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 2019 Apr 29;10(1):1930. doi: 10.1038/s41467-019-09982-5. PMID: 31036827; PMCID: PMC6488672.
[3]Pan RY, He L, Zhang J, Liu X, Liao Y, Gao J, Liao Y, Yan Y, Li Q, Zhou X, Cheng J, Xing Q, Guan F, Zhang J, Sun L, Yuan Z. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease. Cell Metab. 2022 Apr 5;34(4):634-648.e6. doi: 10.1016/j.cmet.2022.02.013. Epub 2022 Mar 17. PMID: 35303422.
[4]Fan W, Zeng S, Wang X, Wang G, Liao D, Li R, He S, Li W, Huang J, Li X, Liu J, Li N, Hou S. A feedback loop driven by H3K9 lactylation and HDAC2 in endothelial cells regulates VEGF-induced angiogenesis. Genome Biol. 2024 Jun 25;25(1):165. doi: 10.1186/s13059-024-03308-5. PMID: 38918851; PMCID: PMC11197246.
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